Метод определения полиморфизма гена АПФ                                                                                              

 

1. Выделение ДНК из эпителиальных клеток  ротовой полости.

 

1.1. После гигиены полости рта испытуемому взять в рот 10 мл изотонического раствора хлористого натрия (0.9%) и в течение 45 сек полоскать энергично  рот, затем раствор вылить обратно в пробирку

1.2. Эпителиальные клетки осадить из раствора центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин (центрифуга СМ-50 для пробирок типа Eppendorf)

1.3. Супернатант слить, к осадку клеток добавить 1 мл 10 мМ ЭДТА в изотоническом растворе хлористого натрия, перемешать в шейкере, отцентрифугировать в течение 10 мин  при 6000 об/мин, супернатант слить, осадок подсушить фильтровальной бумагой.

1.4. ДНК из клеток выделять экстракцией раствором 20 мМ NaOH (0,5 мл) при 95°  в течение  20 мин с использованием твердотельного микротермостата. После охлаждения пробы центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Супернатант, содержащий ДНК, слить в пробирку и для нейтрализации раствора  добавить 4 мкл 1 н раствора HCl. Содержание ДНК оценивают спектрофотометрически при 260 и 280 нм. Пробы замораживают и хранят до использования при -20°С.

 

2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

 

ПЦР проводить в присутствии трех олигонуклеотидных праймеров. Амплификацию проводить в термоциклере при трех температурных режимах, соответствующих трем этапам амплификации  (денатурация, отжиг и синтез ДНК):

95°С – 5 мин, 32 цикла ( 95°С – 1 мин, 54 °С – 1 мин, 72°С – 40 с) и 5 мин при 72°С.

 

3.Определение продуктов амплификации

 

Продукты амплификации разделять методом вертикального электрофореза в 8 % полиакриламидном геле в течение 2 часов при напряжении тока 250 V в 0,09 М трис-боратном буфере, рН 9,0.

Гели окрашивать в водном растворе этидий-бромида и просматривать в проходящем ультрафиолетовом свете  на трансиллюминаторе. Продукты амплификации 65 п.о. и 84 п.о. принадлежат И-аллелю и Д-аллелю, соответственно.

 



Сайт управляется системой uCoz