1. Выделение
ДНК из эпителиальных клеток ротовой
полости.
1.1. После гигиены полости рта испытуемому взять в рот 10 мл изотонического раствора хлористого натрия (0.9%) и в течение 45 сек полоскать энергично рот, затем раствор вылить обратно в пробирку
1.2. Эпителиальные клетки осадить из раствора центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин (центрифуга СМ-50 для пробирок типа Eppendorf)
1.3. Супернатант слить, к осадку клеток добавить 1 мл 10 мМ ЭДТА в изотоническом растворе хлористого натрия, перемешать в шейкере, отцентрифугировать в течение 10 мин при 6000 об/мин, супернатант слить, осадок подсушить фильтровальной бумагой.
1.4. ДНК из клеток выделять экстракцией раствором 20 мМ NaOH (0,5 мл) при 95° в течение 20 мин с использованием твердотельного микротермостата. После охлаждения пробы центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Супернатант, содержащий ДНК, слить в пробирку и для нейтрализации раствора добавить 4 мкл 1 н раствора HCl. Содержание ДНК оценивают спектрофотометрически при 260 и 280 нм. Пробы замораживают и хранят до использования при -20°С.
2. Полимеразная
цепная реакция (ПЦР)
ПЦР проводить в присутствии трех олигонуклеотидных праймеров. Амплификацию проводить в термоциклере при трех температурных режимах, соответствующих трем этапам амплификации (денатурация, отжиг и синтез ДНК):
95°С – 5 мин, 32 цикла ( 95°С – 1 мин, 54 °С – 1 мин, 72°С – 40 с) и 5 мин при 72°С.
3.Определение
продуктов амплификации
Продукты амплификации разделять методом вертикального электрофореза в 8 %
полиакриламидном геле в течение 2 часов при напряжении тока 250 V в 0,09 М трис-боратном буфере, рН 9,0.
Гели окрашивать в водном растворе этидий-бромида
и просматривать в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Продукты амплификации 65 п.о. и 84 п.о. принадлежат И-аллелю
и Д-аллелю, соответственно.